體外診斷試劑參考區間確定注冊審查指導原則（2022年第36號）旨在指導醫療器械注冊申請人對注冊申報資料中參考區間研究資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。本指導原則是對體外診斷試劑參考區間確定的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
體外診斷試劑參考區間確定注冊審查指導原則
本指導原則旨在指導醫療器械注冊申請人對注冊申報資料中參考區間研究資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。
本指導原則是對體外診斷試劑參考區間確定的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是供醫療器械注冊申請人和技術審評人員使用的指導文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。
本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。
一、適用范圍
本指導原則適用于定量檢測體外診斷試劑參考區間的確定研究。本文主要討論健康人群相關的參考區間，申請人也可用類似方法建立其他類型參考人群的參考區間，如其他特定生理或病理條件的參考區間。
本指導原則不適用于定性和半定量檢測試劑；不適用于藥物濃度監測用途的檢測試劑；不適用于致病性病原體相關檢測試劑；不適用于醫學決定水平的確定。已經有國內公認、統一的參考區間和醫學決定水平的檢測項目，可不再建立參考區間，此類產品應將評估重點放在標準化方面。
本指導原則適用于進行相關產品注冊和變更注冊的體外診斷試劑參考區間確定，包括申報資料中的部分要求，其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監督管理總局令48號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。
二、基本原則
應按照以下情況,分別選擇建立和驗證的方式確定申報產品的參考區間：
1.首個申報產品（境內無同類已批準上市注冊產品）
1.1境內申報產品應通過建立的方法，確定申報產品的參考區間。
1.2進口申報產品，如在境外申請人注冊地或者生產地所在國家（地區）已批準上市，申請人需驗證申報產品說明書載明的參考區間的適用性。如驗證不通過，需建立適用于中國人群的參考區間。未在境外申請人注冊地或生產地所在國家（地區）上市的創新醫療器械，應建立包含中國人群參考區間。
2.國內已有同類產品批準上市的申報產品，可選擇自行建立參考區間，也可以選擇驗證該產品境外注冊試劑說明書中的參考區間（進口注冊適用），或其他國內已注冊產品參考區間，但應首選注冊申報中臨床試驗或臨床評價中方法學比對時，所選擇的對比試劑的參考區間進行驗證。如驗證通過，可直接采用經驗證的參考區間；如驗證不通過，應建立參考區間。
上述參考區間的驗證應滿足下文“（二）參考區間的驗證”章節相關條件；參考區間的建立應滿足下文“（一）參考區間的建立”章節相關要求。
三、技術審查要點
（一）參考區間的建立
1.參考樣本組的選擇
1.1制定參考個體的選擇標準
篩選參考個體時，應首先確定檢測項目的適用人群，除成年表觀健康人外，適用時，也應考慮納入未成年人（如評估生長發育的指標）或老年人（如評估衰老相關疾病的指標），絕經前和絕經后表觀健康女性個體（如部分女性相關腫瘤標志物、骨代謝標志物等），不同月經周期女性（如性激素）等；對于特定體液樣本類型，如腦脊液，可考慮將非相關病理人群的特定評估指標作為參考個體的篩選標準。應根據申報產品個性化定義“表觀健康”，評估可能的生理及病理影響因素，據此設定明確的納入、排除標準。應依據納入、排除標準設計參考個體調查問卷，并采取必要的措施保證問卷填寫的準確、客觀。
綜上，針對不同檢測項目參考個體的排除標準也不盡相同，表1中列出應予以考慮的部分排除因素，申請人應根據檢測項目的不同，增加或減少排除標準。
表1 參考個體選擇應考慮的排除因素
飲酒 | 妊娠或哺乳期 | 血壓異常 |
肥胖 | 近期或既往疾病 | 獻血 |
吸煙 | 維生素濫用 | 近期外科手術 |
環境因素 | 藥物濫用 | 飲食情況（如素食、節食） |
遺傳因素 | 特殊職業 | 藥物（處方、非處方及避孕藥） |
劇烈運動 | 近期輸血史 | 近期住院或正在住院治療 |
1.2制定參考個體的分組標準
根據所篩選參考個體的特征，考慮其是否對臨床決策具有意義等情況，對其進行分組。研究者應根據檢測項目的不同，合理設計分組條件。潛在分組條件可以是年齡、性別、血型、種族、晝夜節律、飲食、吸煙、運動、月經周期、妊娠階段、采樣時間、地理位置、職業等因素。
1.3 參考個體的選擇
參考個體選擇時，應按照明確的標準采用直接抽樣的方式進行選擇。參考個體應盡可能接近檢測項目的臨床患者分布組成，盡可能涵蓋各年齡組內不同年齡段，且男女個體數量應相當(適用時），地域選擇應具有代表性。參考個體分布特征應盡量接近社區人群分布。注冊申請人根據產品特點設計納入、排除標準，將符合標準的具有人群代表性的個體納入參考人群。建議通過多中心招募的形式納入參考人群。
2.樣本采集與處理
2.1參考個體準備
參考個體的狀態指對檢測項目結果具有影響的狀態。樣本采集前進食會對許多檢測項目有直接（濃度改變）或間接（脂類物質干擾）的影響，長期節食也會造成許多檢測指標的改變。另外，咖啡因、酒精、香煙和維生素C等，也會對許多檢測項目的檢測結果產生影響。因此，應該對參考個體各項可能產生影響的因素（表2）進行評價，保證狀態良好方可進行樣本的采集。
表2 參考個體的狀態因素
先前的飲食 | 禁食或非禁食 | 藥物戒斷 | 生物節奏和采樣時間 |
藥物攝取 | 身體活動 | 壓力 | 采樣前的休息時期 |
2.2樣本的采集、處理和儲存
影響參考樣本采集、處理和儲存的因素包括采樣環境、采樣時間、采樣體位、樣本類型、運送方式、樣本狀態、樣本分離、儲存方式等。申請人應采用符合說明書聲稱要求的樣本進行參考區間研究，并在研究報告中詳細說明樣本類型、儲存方式等情況。如檢測采用血液樣本，應區分動脈血、靜脈血及毛細血管血；如需使用抗凝劑，需明確抗凝劑的類型；如采集尿液樣本應明確取樣時間段（如適用）。
3.樣本檢測
應采用檢測系統進行參考樣本的檢測。檢測系統包括樣本處理用產品、檢測試劑、校準品、質控品、檢測設備等。
4.數據分析
依據臨床意義的不同，參考區間研究需要確定檢測項目的單側界值或雙側界值。通常使用雙側2.5%～97.5%人群分布，單側時可選擇95%或5%。
4.1參考樣本數量
研究至少需要120例參考樣本,此時可對參考限的90%置信區間進行準確估計。參考限的置信區間不同，所需參考樣本量也不盡相同，具體見表3。如需分組評估，則每組均需要滿足相應置信區間的參考樣本量要求。如有離群值，則應在剔除離群值后補足相應參考樣本例數。
表3 95%參考區間的不同置信區間最少樣本數量
參考限的置信區間 | 樣本數量 |
90% | 120 |
95% | 146 |
99% | 210 |
4.2繪制分布圖
繪制分布圖用以了解數據分布特征，并對數據進行審查。
為了解數據的分布特性，需對數據是否呈正態分布進行判斷，即數據對稱性和正態峰的判斷。數據對稱性和正態峰的判斷可通過直方圖、正態概率圖，或采用假設檢驗的方法進行綜合判斷，常用的假設檢驗方法有矩法、W檢驗法、KS檢驗法等。
4.3數據離群值的判斷
申請人應采用合理的統計分析方法進行離群值的判定。此處推薦兩種方法：
4.3.1 Dixon方法（適用于非正態分布數據）
4.3.1.1在參考值檢測數據中，如果有疑似離群數據，應將疑似離群值的檢測結果和其相鄰值的差D和數據（包含疑似離群值）全距R相除，若D/R≥1/3考慮為離群值。
4.3.1.2若同側有2個或以上疑似離群點，可從最小的疑似離群點起作如上處理，若D/R都大于1/3，則所有疑似點都定義為離群值；若D/R都小于1/3，則保留所有疑似數據。
4.3.2 Tukey法（適用于正態分布數據）
4.3.2.1 計算數據集的四分位數，定義為Q3（75%分位數）和Q1（25%分位數）。計算四分位間距，定義為IQR(Q3-Q1)。將大于四分位間距上限：Q3+1.5×IQR或小于四分位間距下限：Q1-1.5×IQR的參考值定義為離群值。
4.3.3如出現離群值，應對離群值產生原因進行分析，如果有明確的原因，如檢測時操作錯誤等，可將離群值剔除，如無明確原因，應將該數據保留。
4.4數據分組
數據是否需要分組，需根據參考區間分組是否對臨床決策具有意義或檢測項目具有明確的生理學意義，且必須對不同亞組之間的差別進行統計學假設檢驗，檢驗結果應顯示差異有統計學意義。
申請人應結合數據分布特征選擇適當的統計假設方法進行數據分組判定。如數據呈正態分布，申請人可采用Z檢驗，確定分組后的均值間差異有無統計上的顯著性。
式中，
1——第一組參考值的均值
2——第二組參考值的均值
s1 ——第一組參考值的標準差
s2 ——第二組參考值的標準差
n1——第一組參考值的數量
n2 ——第二組參考值的數量
n——平均樣本量
如s2＞1.5s1或s2/（s2-s1）＜3時，可以考慮分組；如計算Z值超過Z*時，也可考慮成分組。
4.5建立參考區間
依據數據分布特征，計算參考區間的常用方法包括參數法和非參數法。
4.5.1經正態性檢驗后，如參考值數據近似正態分布或檢測數據經變量轉換后呈正態分布，可采用正態分布法確定參考區間，樣本量要求見表3。用該方法確定的參考區間所得結果穩定，受兩端數據影響較小。
可采用下述公式進行參考區間的計算：
雙側1-α參考區間：`X±Z1-α/2S
單側1-α參考區間：＞`X -Z1-αS或＜`X＋Z1-αS
式中`X為均數，S為標準差。
4.5.2經正態性檢驗后，如參考值數據呈偏態分布，可采用百分位數法（非參數法）確定參考區間，樣本量要求見表3。該方法受兩端數據影響較大，樣本含量較小時結果不穩定、不宜選用。將n個參考個體檢測值按照從小到大的順序排列，并依次編上秩次。把n個秩次分為100等分，與r%秩次對應的數稱為第r百分位數，用Pr表示。分別計算參考值下限r1（2.5百分位數）和參考值上限r2（97.5百分位數）作為檢測項目的95%參考區間。還需計算參考限的90%或95%置信區間。若r值計算值不是整數，可將它們四舍五入后取整。
（二）參考區間的驗證
1.驗證條件
采用驗證的方法確定申報試劑參考區間時，需要滿足以下條件：第一，原始參考區間的研究應系統全面，具有可信性，如已發布實施的臨床檢測參考區間標準等;第二，檢測系統需具有可比性；第三，參考區間研究的分析前因素需具有可比性，如參考個體的狀態，標本采集和處理程序等; 第四，參考人群的適宜性。原始參考區間研究所采用的參考人群應在人群分布的地理位置、人口統計學特征等方面與申報試劑預期適用人群相一致，或包含符合參考區間建立參考樣本數量要求的上述參考人群。如不能同時滿足上述條件，申請人需按照前文所述方法建立自己的參考區間。
申請人應通過方法學比對的方法，對申報產品與原始參考區間建立時的檢測系統的可比性進行研究。方法學比對研究方法，可參考《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術指導原則》（國家藥品監督管理局2021第74號公告）。注意兩檢測系統檢測結果應具有高度一致性。申請人應通過列表的方式，對比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區間研究分析前的因素等。
2.參考區間的驗證
申請人應選擇至少20例與申報產品預期使用人群地理分布和人口統計學特征相似的參考個體，在具有與原始參考區間研究一致的分析前因素和相同的檢測條件下，研究小樣本人群的參考值。比較小樣本參考值和原始參考區間之間的可比性。如果20例參考個體中只有不超過2例的參考值超出原始參考區間，即通過驗證，可以直接使用原始參考區間。如參考個體多于20例，則超出原始參考區間的數據不超過檢測結果的10%，即通過驗證；若有10%以上的數據超出原始參考區間，則應另選至少20例參考個體，重新按照上述判斷標準進行驗證。若參考區間驗證使用了其他參考界值，則對應的驗證標準需滿足統計學要求的。若驗證結果符合要求，可直接使用原始參考區間，反之則應檢查所有的分析程序，考慮樣本是否有生物學差異，并按照前文所述方法建立自己的參考區間。
在統計學上，隨著樣本量的增加，利用統計原理發現人群差異的能力更強。因此，申請人可以加大參考個體的樣本量，如采用60例樣本，并將測得的參考值與原始參考區間比較，判斷參考值和原始參考區間之間是否具有可比性。
（三）說明書
申請人應在說明書【參考區間】中載明經研究確定的參考區間。此部分內容應包含參考區間確定的基本信息，包括：樣本量、參考人群特征（如性別、年齡、種族等）和參考區間確定采用的統計學方法。
四、其他應注意的問題
無論是建立自己的參考區間或驗證參考區間，都要確保參考區間的可溯源性，記錄確定參考區間的所有步驟，包括參考個體的選擇、分析前因素、樣本檢測以及統計分析方法等。
五、名詞解釋
1.參考個體（reference individual）：根據明確標準選擇出進行實驗的個體。通常是符合特定標準的健康個體。
2. 參考人群（reference population）：由所有參考個體組成的群體。
注：通常情況下參考人群中的個體數是未知的，因此參考人群是一個假設實體。
3.參考樣本組（reference sample group）：從參考人群中選出的用以代表參考人群的足夠數量的個體。
4.參考值（reference value）：通過對參考個體某一特定量進行觀察或測量而得到的值（檢驗結果）。
5.參考分布（reference distribution）：一組參考值的分布。
6.參考限（reference limit）：源自參考值的分布，用于描述部分參考值的位置（小于或等于、大于或等于、上限/下限）。
7.參考區間（reference interval）：來自生物參考人群的數值的特定分布區間。
注：在有些情況下，只有一端的生物學參考界限是重要的，通常是上限“x”，相應的參考區間將是小于或等于“x”。
六、參考文獻
[1] GB/T 29791.1-2013，體外診斷醫療器械制造商提供的信息（標示）第1部分：術語、定義和通用要求[S].
[2] CLSI. Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guideline—Third Edition. CLSI document EP28-A3c. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010.
[3] WS/T 402-2012，臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定[S].
[4] WS/T 780-2021，兒童臨床常用生化檢驗項目參考區間[S].